病毒灭活试验报告

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病毒灭活试验器材：
1、试验用病毒株:脊髓灰质炎病毒1型(poliovirus- I，PV- I )；疫苗株;艾滋病病毒1型(HIV-1)美国株。
2、宿主细胞:可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL、细胞系，作为PV-1的测试细胞。用含有人T淋巴细胞白血病病毒1型(human T cell leukemiavirus 1, HTLV-1)基因的人淋巴细胞(株)作为HIV-1的测试细胞。
3、细胞培养瓶与96孔培养板。
4、恒温水浴箱。
5、二氧化碳培养箱。
6、层流**净工作台。
7、低温冰箱(-20°C， -80°C)。
8、液氮罐。
9、倒置显微镜。
10、离心机。
11、可调移液器及配套一 次性塑料吸头。
12、细胞维持培养基。
13、细胞完全培养基。
14、去离子水。

病毒灭活试验病毒悬液的制备：
1、从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37°C温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀,立即离心(3000r/min， 3min) ，去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
2、取出低温冻存的试验病毒毒种，37°C水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37°C温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。
3、将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波(或反复冻融)破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心(6000r/min,15min)去除沉淀(主要为细胞碎片)，上清液即为所需的病毒悬液。按每管1. 0分装于无菌离心管(1.5)中。
4、取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80°C备用。

病毒灭活的机理有三:
1、破坏包膜：包膜含有脂类物质，因之有包膜的病毒可迅速被脂溶剂破坏，如、仿或去氧胆酸钠可使病毒灭活。实际上可利用病毒对脂溶剂的敏感性来检查病毒是否有包膜。物理因子，如渗透压改变、冻融、热和干燥等都可引起包膜破坏。一般认为，呼吸道感染的病毒对于燥抵抗力弱，传播主要是人间直接感染，这是因为有包膜的原故。
2、病毒蛋白质变性：能使蛋白质变性的化学制剂都能使病毒灭活，如酚、、次化物、酸和碱等。加热引起变性也是有效灭活的方法。一般说病毒对热抵抗力弱，60°C几分钟就使之感染性明显降低，因此在分离病毒时，从患者取来的标本需低温保存，迅速送往实验室，长期保存置于-80°C以下的低温条件。
3、病毒核酸的损害：、y线等电离辐射可切断核酸，紫外线可使核苷酸链上相邻的嘧啶碱基形成二聚物，而破坏病毒基因的功能。另外吖啶橙或中性红等染料可与病毒核酸结合，暴露于光线之下，可使核酸分解，而使病莓灭活。

病毒灭活滴度计算方法：终点稀释法病毒感染滴度的计算以半数细胞感染剂量(TCID5o) 表示。TCID5o 的对数值计算公式如下。
TCID5o对数值=病变率**50%组稀释度的对数值+距离比例(“病变率**50%组”是指病变率**过50%的组,下简称“**50% 组”;“病变率低于50%组”是指病变率低于50%的组，下简称“低于50%组”)。
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