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将少数菌落转移到纤维素滤膜上
(1) 在含有选择性的琼脂平板上放一张纤维素滤膜。
(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。后,在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。
(4) 用已装防水黑色绘图墨水的针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。
(6) 裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA结合于纤维素滤膜。
后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),植物染色体原位杂交技术服务,含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
原位杂交的预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体,不洗。
杂交——按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交专1用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。